مفاهیم و مبانی علمی
AO/PI چیست؟ کاربرد آکریدین اورنج و پروپیدیوم یدید در سنجش زنده‌مانی سلول
مهر
AO/PI چیست؟
AO/PI یک روش رنگ‌آمیزی فلورسنت برای شمارش سلول و بررسی زنده‌مانی سلولی است که از ترکیب دو رنگ آکریدین اورنج (AO) و پروپیدیوم یدید (PI) استفاده می‌کند. در این روش، سلول‌های زنده دارای هسته معمولاً با فلورسانس سبز و سلول‌هایی که غشای آن‌ها آسیب دیده و زنده نیستند با فلورسانس قرمز یا نارنجی قابل تشخیص هستند.
این ویژگی باعث شده است رنگ‌آمیزی AO/PI در کشت سلول، بانک‌های سلولی، تحقیقات سرطان، سلول‌های بنیادی، نمونه‌های خونی و بسیاری از آزمایش‌هایی که نیاز به تعیین سریع تعداد سلول‌های زنده و مرده دارند، مورد استفاده قرار گیرد.
AO/PI در یک نگاه
| ویژگی | توضیح |
|---|---|
| نام کامل AO | آکریدین اورنج |
| نام کامل PI | پروپیدیوم یدید |
| نوع آزمون | رنگ‌آمیزی فلورسنت زنده‌مانی سلولی |
| سلول زنده | معمولاً سبز |
| سلول مرده | قرمز یا نارنجی |
| اساس تشخیص | سلامت یا آسیب غشای سلولی |
| کاربرد اصلی | شمارش سلول و تعیین درصد زنده‌مانی |
| تجهیزات مورد نیاز | میکروسکوپ فلورسانس یا شمارنده سلولی فلورسنت |
| نمونه مناسب | سلول‌های هسته‌دار |
| محدودیت مهم | قادر به تشخیص دقیق مراحل اولیه آپوپتوز نیست |
چرا بررسی زنده‌مانی سلول اهمیت دارد؟
تعداد سلول موجود در یک نمونه به‌تنهایی اطلاعات کافی درباره کیفیت آن نمی‌دهد. ممکن است یک سوسپانسیون حاوی تعداد زیادی سلول باشد، اما بخش قابل توجهی از آن‌ها در اثر پاساژ نامناسب، انجماد و ذوب‌سازی، سمیت یک ماده یا شرایط نامناسب کشت آسیب دیده باشند.
به همین دلیل، در بسیاری از آزمایش‌ها باید علاوه بر تعداد کل سلول‌ها، درصد سلول‌های زنده نیز مشخص شود.
این موضوع در مواردی مانند زیر اهمیت بیشتری دارد:
- کشت و پاساژ سلول
- انجماد و ذوب‌سازی سلول‌ها
- آزمایش‌های سمیت سلولی
- آماده‌سازی نمونه برای کشت مجدد
- مطالعات سلول‌های بنیادی
- آماده‌سازی نمونه برای روش‌های تک‌سلولی
- جداسازی و شمارش سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی
- کنترل کیفیت بانک‌های سلولی
زنده‌مانی سلولی معمولاً به صورت درصد سلول‌های زنده نسبت به کل سلول‌های شمارش‌شده گزارش می‌شود.
آکریدین اورنج چیست؟
آکریدین اورنج یک رنگ فلورسنت نفوذپذیر به غشای سلولی است که می‌تواند وارد سلول‌های دارای غشای سالم شود و به اسیدهای نوکلئیک متصل شود.
در روش AO/PI که برای شمارش سلولی استفاده می‌شود، آکریدین اورنج باعث مشاهده هسته سلول‌های هسته‌دار در کانال فلورسانس سبز می‌شود.
از آنجا که AO می‌تواند وارد سلول‌های زنده و مرده شود، اساساً برای **شناسایی جمعیت کل سلول‌های هسته‌دار** مورد استفاده قرار می‌گیرد.
این ویژگی به‌خصوص در نمونه‌هایی مانند PBMC اهمیت دارد؛ زیرا سلول‌های قرمز بالغ خون فاقد هسته هستند و در شمارش مبتنی بر AO/PI مانند سلول‌های هسته‌دار علامت‌گذاری نمی‌شوند.
پروپیدیوم یدید چیست؟
پروپیدیوم یدید یک رنگ فلورسنت متصل‌شونده به اسیدهای نوکلئیک است، اما برخلاف آکریدین اورنج نمی‌تواند به‌راحتی از غشای سالم سلول عبور کند.
بنابراین:
سلول دارای غشای سالم → ورود PI محدود است
اما:
سلول با غشای آسیب‌دیده → PI وارد سلول می‌شود و به اسیدهای نوکلئیک متصل می‌شود
در نتیجه سلول‌های دارای غشای آسیب‌دیده با فلورسانس قرمز یا نارنجی مشاهده می‌شوند.
همین تفاوت در نفوذپذیری غشا اساس استفاده از PI برای شناسایی سلول‌های غیرزنده است.
مکانیسم رنگ‌آمیزی AO/PI چگونه است؟
اساس آزمون بسیار ساده است:
در سلول زنده
- غشای سلولی سالم است.
- آکریدین اورنج وارد سلول شده و اسیدهای نوکلئیک را رنگ‌آمیزی می‌کند.
- در نتیجه سلول در کانال مناسب به صورت سبز مشاهده می‌شود.
در سلول مرده
- غشای سلولی آسیب دیده است.
- علاوه بر AO، پروپیدیوم یدید نیز وارد سلول می‌شود و به اسیدهای نوکلئیک متصل می‌شود.
- در شرایط استاندارد آزمون AO/PI، سیگنال PI غالب شده و سلول به صورت قرمز یا نارنجی دیده می‌شود.
- در روش استانداردشده AO/PI برای سلول‌های هسته‌دار نیز همین اصل مورد استفاده قرار می‌گیرد: سلول‌های زنده سبز و سلول‌های غیرزنده قرمز شناسایی می‌شوند.
چگونه نتایج AO/PI را تفسیر کنیم؟
تفسیر معمول آزمون به این صورت است:
| سلول | AO | PI | نتیجه ظاهری |
|---|---|---|---|
| سلول زنده | مثبت | منفی | سبز |
| سلول با غشای آسیب‌دیده | مثبت | مثبت | قرمز یا نارنجی |
بنابراین با شمارش تعداد سلول‌های سبز و قرمز می‌توان درصد زنده‌مانی نمونه را تعیین کرد.
فرمول زنده‌مانی سلولی
درصد زنده‌مانی = تعداد سلول‌های زنده ÷ تعداد کل سلول‌ها × 100
برای مثال اگر در یک نمونه:
- 90 سلول زنده
- 10 سلول مرده
مشاهده شود:
درصد زنده‌مانی برابر با 90 درصد خواهد بود.
AO/PI برای چه کاربردهایی استفاده می‌شود؟
شمارش سلول‌های زنده و مرده
یکی از مهم‌ترین کاربردهای AO/PI، تعیین هم‌زمان تعداد سلول‌های زنده و مرده است.
در شمارنده‌های سلولی فلورسنت، نرم‌افزار دستگاه می‌تواند سلول‌های سبز و قرمز را به صورت جداگانه شناسایی کرده و موارد زیر را گزارش کند:
- تعداد کل سلول‌ها
- غلظت سلولی
- تعداد سلول‌های زنده
- تعداد سلول‌های مرده
- درصد زنده‌مانی
بررسی کیفیت سلول پس از ذوب‌سازی
فرایند انجماد و ذوب‌سازی می‌تواند باعث آسیب غشای سلولی شود.
به همین دلیل یکی از زمان‌های مناسب برای تعیین زنده‌مانی، پس از ذوب کردن سلول‌های فریز شده است.
اگر درصد زیادی از سلول‌ها PI مثبت باشند، ممکن است عواملی مانند:
- شرایط نامناسب انجماد
- سرعت نامناسب کاهش دما
- شرایط نامناسب نگهداری
- آسیب هنگام ذوب‌سازی
- یا سمیت مواد محافظ انجماد
در کاهش زنده‌مانی نقش داشته باشند.
بررسی کیفیت سلول پس از پاساژ
- استفاده بیش از حد از آنزیم‌های جداکننده، پیپتاژ شدید یا باقی ماندن طولانی سلول در شرایط نامناسب می‌تواند باعث آسیب به سلول‌ها شود.
- AO/PI می‌تواند برای بررسی کیفیت سوسپانسیون حاصل از پاساژ نیز استفاده شود.
آزمایش‌های سمیت سلولی
- اگر سلول‌ها با یک ترکیب شیمیایی، دارو، نانوذره یا ماده آزمایشی مواجه شوند، می‌توان از AO/PI برای بررسی افزایش سلول‌های دارای غشای آسیب‌دیده استفاده کرد.
- البته باید توجه داشت که AO/PI صرفاً یکی از روش‌های سنجش زنده‌مانی است و الزاماً جایگزین آزمون‌های متابولیکی مانند MTT یا سایر روش‌های بررسی سمیت نمی‌شود.
شمارش PBMC و نمونه‌های خونی
- یکی از مزایای مهم رنگ‌آمیزی AO/PI در نمونه‌های خونی، شناسایی اختصاصی‌تر سلول‌های هسته‌دار است.
- سلول‌های قرمز بالغ خون هسته ندارند و بنابراین در رنگ‌آمیزی مبتنی بر اسید نوکلئیک مانند سلول‌های هسته‌دار شمارش نمی‌شوند. این موضوع می‌تواند در شمارش PBMC و سایر سلول‌های هسته‌دار خون مزیت ایجاد کند. مطالعات مقایسه‌ای نیز از استفاده AO/PI برای شمارش فلورسنت PBMC حمایت کرده‌اند.
تفاوت AO/PI و تریپان بلو چیست؟
هر دو روش برای بررسی زنده‌مانی سلولی استفاده می‌شوند، اما اساس مشاهده و نحوه شمارش آن‌ها متفاوت است.
| ویژگی | AO/PI | تریپان بلو |
|---|---|---|
| نوع رنگ | فلورسنت | غیر فلورسنت |
| سلول زنده | سبز | بدون رنگ |
| سلول مرده | قرمز/نارنجی | آبی |
| نوع میکروسکوپ | فلورسانس | نوری |
| قابلیت شمارش خودکار | بسیار مناسب | امکان‌پذیر |
| تشخیص سلول هسته‌دار | بهتر | اختصاصیت کمتر |
| تأثیر دبری بر شمارش | در سیستم‌های فلورسنت معمولاً کمتر | می‌تواند مشکل‌ساز باشد |
| هزینه و تجهیزات | بیشتر | ساده‌تر و ارزان‌تر |
تریپان بلو به دلیل سادگی و عدم نیاز به فلورسانس هنوز یکی از روش‌های متداول شمارش سلولی است. با این حال، AO/PI در نمونه‌های پیچیده یا هنگام استفاده از شمارنده‌های فلورسنت می‌تواند مزیت داشته باشد.
در یک مطالعه مقایسه‌ای کلاسیک روی سلول‌های خونساز، آزمون AO/PI رابطه خطی بسیار خوبی با زنده‌مانی مورد انتظار نشان داد و تریپان بلو به‌خصوص در نمونه‌هایی با زنده‌مانی پایین، درصد سلول‌های زنده را بیشتر برآورد کرد.
با این حال نمی‌توان گفت AO/PI در تمام آزمایش‌ها الزاماً «بهتر» از تریپان بلو است؛ انتخاب روش باید بر اساس نوع نمونه، تجهیزات موجود، دقت مورد نیاز و هدف آزمایش انجام شود.
تفاوت AO/PI با MTT چیست؟
AO/PI و MTT هر دو ممکن است در مطالعات زنده‌مانی و سمیت سلولی استفاده شوند، اما یک چیز را اندازه‌گیری نمی‌کنند.
AO/PI
به‌طور مستقیم سلول‌ها را بر اساس سلامت غشای آن‌ها تفکیک می‌کند و امکان شمارش سلول‌های زنده و مرده را فراهم می‌کند.
MTT
بر اساس فعالیت متابولیکی سلول‌ها عمل می‌کند و نتیجه آن معمولاً به صورت جذب نوری گزارش می‌شود.
بنابراین:
- AO/PI: شمارش و سلامت غشای سلولی
- MTT: فعالیت متابولیکی جمعیت سلولی
این دو روش در برخی مطالعات می‌توانند مکمل یکدیگر باشند، اما نتایج آن‌ها نباید به عنوان دو اندازه‌گیری کاملاً یکسان تفسیر شوند.
تفاوت AO/PI با Annexin V/PI چیست؟
این دو آزمون نیز نباید با یکدیگر اشتباه گرفته شوند.
AO/PI عمدتاً برای تعیین زنده‌مانی بر اساس سلامت غشای سلولی به کار می‌رود.
اما Annexin V/PI برای بررسی مراحل مرگ سلولی و به‌ویژه تمایز بهتر بین:
- سلول زنده
- آپوپتوز اولیه
- آپوپتوز دیررس
- سلول مرده
استفاده می‌شود.
سلولی که در مراحل اولیه آپوپتوز قرار دارد ممکن است هنوز غشای نسبتاً سالمی داشته باشد و بنابراین در آزمون ساده AO/PI به‌عنوان سلول زنده شمارش شود.
پس AO/PI را نباید یک آزمون کامل برای تعیین مراحل آپوپتوز در نظر گرفت.
برای انجام AO/PI به چه تجهیزاتی نیاز داریم؟
بسته به روش و کیت مورد استفاده، تجهیزات می‌توانند متفاوت باشند، اما معمولاً نیاز به یکی از موارد زیر است:
- میکروسکوپ فلورسانس
- شمارنده سلولی فلورسنت
- سیستم تصویربرداری فلورسنت
دستگاه باید توانایی تفکیک سیگنال سبز AO و سیگنال قرمز PI را داشته باشد.
در شمارنده‌های خودکار، سیستم می‌تواند تصاویر فلورسنت را تحلیل کرده و غلظت و درصد زنده‌مانی را به‌طور خودکار محاسبه کند. Thermo Fisher نیز AO و PI را به‌عنوان ترکیب رایج برای شمارش فلورسنت سلول‌های زنده و مرده معرفی می‌کند.
مراحل کلی رنگ‌آمیزی AO/PI
پروتکل دقیق باید همیشه براساس دستورالعمل کیت و دستگاه مورد استفاده انجام شود، زیرا غلظت رنگ، نسبت نمونه به رنگ و زمان خوانش بین محصولات مختلف می‌تواند متفاوت باشد.
روند کلی معمولاً شامل مراحل زیر است:
- تهیه یک سوسپانسیون یکنواخت از سلول‌ها
- برداشتن حجم مشخصی از نمونه
- مخلوط کردن نمونه با محلول AO/PI طبق دستورالعمل کیت
- انتقال نمونه به لام، هموسیتومتر یا اسلاید شمارش مخصوص دستگاه
- مشاهده یا شمارش در کانال‌های فلورسنت مناسب
- شمارش سلول‌های سبز و قرمز
- محاسبه غلظت و درصد زنده‌مانی
یکی از استانداردهای منتشرشده برای AO/PI نیز بر تهیه سوسپانسیون تک‌سلولی، اندازه‌گیری در زمان مشخص پس از رنگ‌آمیزی و انجام تکرارهای مناسب تأکید می‌کند.
چه عواملی باعث خطا در آزمون AO/PI می‌شوند؟
تجمع سلولی
- اگر سلول‌ها به شکل توده یا کلامپ باشند، شمارنده ممکن است چند سلول را به‌عنوان یک سلول شناسایی کند یا نتواند رنگ هر سلول را به‌درستی تفکیک کند.
- بنابراین بهتر است نمونه تا حد امکان به صورت سوسپانسیون تک‌سلولی آماده شود.
غلظت بسیار زیاد یا بسیار کم سلول
- هر دستگاه و کیت محدوده شمارش مشخصی دارد.
- اگر غلظت نمونه خارج از محدوده توصیه‌شده باشد، نتیجه می‌تواند دقت کمتری داشته باشد.
- در چنین شرایطی ممکن است نیاز به رقیق‌سازی یا تغلیظ نمونه باشد.
تأخیر زیاد در خوانش
- رنگ‌آمیزی سلولی یک فرایند وابسته به زمان است و نباید نمونه برای مدت نامشخص پس از مخلوط شدن با رنگ باقی بماند.
- زمان خوانش باید مطابق دستورالعمل کیت ثابت نگه داشته شود تا قابلیت مقایسه نمونه‌ها حفظ شود.
وجود دبری (Debris) و ذرات
- در برخی نمونه‌ها، قطعات سلولی و مواد غیرسلولی ممکن است شمارش را تحت تأثیر قرار دهند.
- استفاده از شمارنده فلورسنت همراه با تنظیم مناسب محدوده اندازه و شدت فلورسانس می‌تواند بخشی از این خطا را کاهش دهد.
تنظیم نامناسب دستگاه
- شدت نور، Focus، Threshold و تنظیمات کانال‌های فلورسنت می‌توانند روی نتیجه اثر داشته باشند.
- هنگام مقایسه چند نمونه بهتر است تنظیمات دستگاه تا حد امکان ثابت و استاندارد باشند.
آیا AO/PI برای همه سلول‌ها مناسب است؟
- AO/PI به‌ویژه برای بررسی سلول‌های حیوانی هسته‌دار مناسب است.
- یک راهنمای استاندارد منتشرشده در سال 2026 این روش را برای تعیین زنده‌مانی سلول‌های پستانداران هسته‌دار مناسب می‌داند و تصریح می‌کند که این روش برای سلول‌های بدون هسته مناسب نیست.
- بنابراین برای ساختارهایی مانند سلول قرمز بالغ خون که فاقد هسته است، تفسیر آزمون متفاوت خواهد بود.
- نوع سلول، ساختار نمونه و تجهیزات مورد استفاده باید پیش از انتخاب روش در نظر گرفته شوند.
مزایای رنگ‌آمیزی AO/PI
از مهم‌ترین مزایای این روش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
- تشخیص سریع سلول‌های زنده و مرده
- امکان تعیین هم‌زمان تعداد و درصد زنده‌مانی
- قابلیت استفاده در شمارنده‌های خودکار فلورسنت
- مناسب برای بسیاری از سلول‌های هسته‌دار
- کاهش تأثیر برخی ذرات غیرسلولی در سیستم‌های فلورسنت
- مناسب برای نمونه‌های پیچیده مانند PBMC
- امکان مشاهده مستقیم سلول‌های زنده و مرده
محدودیت‌های AO/PI
AO/PI با وجود کاربرد گسترده، محدودیت‌هایی نیز دارد.
- نیاز به تجهیزات فلورسنت
برخلاف تریپان بلو، برای مشاهده مناسب AO/PI به سیستم فلورسنت نیاز است.
- سلامت غشا معیار اصلی است
این آزمون عمدتاً وضعیت غشای سلولی را بررسی می‌کند و تمام جنبه‌های عملکرد سلول را اندازه‌گیری نمی‌کند.
- آپوپتوز اولیه ممکن است شناسایی نشود
سلول در مراحل اولیه آپوپتوز ممکن است هنوز PI منفی باشد.
- نتیجه به کیفیت نمونه وابسته است
تجمع سلولی، دبری، غلظت نامناسب و تأخیر در شمارش می‌توانند نتیجه را تغییر دهند.
- پروتکل محصولات مختلف یکسان نیست
غلظت و نسبت AO و PI در کیت‌های مختلف ممکن است متفاوت باشد؛ بنابراین استفاده از یک پروتکل ثابت برای همه محصولات صحیح نیست.
AO/PI یا تریپان بلو؛ کدام را انتخاب کنیم؟
اگر هدف یک شمارش ساده و کم‌هزینه با میکروسکوپ نوری باشد، تریپان بلو همچنان روش مناسبی است.
اما اگر:
- شمارنده فلورسنت در دسترس باشد،
- نمونه حاوی دبری زیادی باشد،
- نمونه خونی یا PBMC بررسی شود،
- تشخیص اختصاصی‌تر سلول‌های هسته‌دار اهمیت داشته باشد،
- یا شمارش خودکار و تکرارپذیری بیشتر مورد نیاز باشد،
AO/PI می‌تواند گزینه مناسبی باشد.
بنابراین انتخاب بین این دو روش باید بر اساس کاربرد انجام شود، نه صرفاً بر اساس اینکه کدام روش جدیدتر است.
نکات مهم هنگام کار با AO/PI
- پروتکل سازنده کیت را رعایت کنید.
- نمونه را تا حد امکان به صورت تک‌سلولی آماده کنید.
- زمان بین رنگ‌آمیزی و شمارش را ثابت نگه دارید.
- از کانال‌های فلورسنت مناسب استفاده کنید.
- در مطالعات مقایسه‌ای، تنظیمات دستگاه را بین نمونه‌ها تغییر ندهید.
- از کنترل مناسب استفاده کنید.
- رنگ‌ها را مطابق SDS و دستورالعمل ایمنی سازنده حمل و دفع کنید.
- نتیجه AO/PI را معادل آزمون کامل آپوپتوز در نظر نگیرید.
جمع‌بندی
- AO/PI یکی از روش‌های فلورسنت کاربردی برای شمارش سلول و تعیین زنده‌مانی سلولی است.
- در این روش، آکریدین اورنج می‌تواند سلول‌های هسته‌دار را رنگ‌آمیزی کند، در حالی که پروپیدیوم یدید عمدتاً وارد سلول‌هایی می‌شود که یکپارچگی غشای آن‌ها از بین رفته است. در نتیجه سلول‌های زنده معمولاً سبز و سلول‌های غیرزنده قرمز یا نارنجی مشاهده می‌شوند.
- AO/PI به‌ویژه در شمارنده‌های سلولی فلورسنت، بررسی PBMC، کنترل کیفیت کشت سلولی و ارزیابی نمونه‌های پس از انجماد و ذوب‌سازی کاربرد دارد.
- با این حال، این آزمون عمدتاً سلامت غشا را ارزیابی می‌کند و برای بررسی دقیق مراحل آپوپتوز یا فعالیت متابولیکی سلول باید از روش‌های مناسب دیگری نیز استفاده شود.
سوالات متداول درباره AO/PI
AO در AO/PI مخفف چیست؟
AO مخفف Acridine Orange یا آکریدین اورنج است؛ رنگی فلورسنت که می‌تواند وارد سلول‌های هسته‌دار شده و به اسیدهای نوکلئیک متصل شود.
PI در AO/PI چیست؟
PI مخفف Propidium Iodide یا پروپیدیوم یدید است. این رنگ معمولاً نمی‌تواند از غشای سالم عبور کند و به همین دلیل برای شناسایی سلول‌های دارای غشای آسیب‌دیده استفاده می‌شود.
سلول زنده در AO/PI چه رنگی است؟
در شرایط معمول آزمون، سلول‌های زنده سبز و سلول‌های غیرزنده قرمز یا نارنجی دیده می‌شوند.
آیا AO/PI برای شمارش سلول مناسب است؟
بله. این روش علاوه بر تعیین درصد زنده‌مانی می‌تواند در شمارنده‌های فلورسنت برای تعیین غلظت سلولی نیز استفاده شود.
تفاوت AO/PI و تریپان بلو چیست؟
تریپان بلو یک روش غیر فلورسنت است که سلول‌های مرده را آبی می‌کند، در حالی که AO/PI از دو رنگ فلورسنت برای تفکیک سلول‌های زنده و مرده استفاده می‌کند.
آیا AO/PI آپوپتوز را تشخیص می‌دهد؟
AO/PI به‌تنهایی برای تفکیک دقیق مراحل آپوپتوز طراحی نشده است. برای این هدف معمولاً روش‌هایی مانند Annexin V/PI مناسب‌تر هستند.
آیا AO/PI را می‌توان با میکروسکوپ معمولی مشاهده کرد؟
برای استفاده استاندارد از AO/PI به میکروسکوپ یا شمارنده دارای سیستم فلورسانس و فیلترهای مناسب نیاز است.
منابع علمی:
- Wang L, et al. Determination of Cell Viability—Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) Staining Method. Cell Proliferation. 2026;59:e70199. DOI: 10.1111/cpr.70199.
- Thermo Fisher Scientific. ReadyCount Green/Red Viability Stain – Acridine Orange/Propidium Iodide.
- Thermo Fisher Scientific. Peripheral Blood Mononuclear Cell Counting Using the Countess Automated Cell Counters.
- Mascotti K, McCullough J, Burger SR. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion. 2000;40(6):693–696.
- Thermo Fisher Scientific. Viability Staining Protocol for Flow Cytometry – Propidium Iodide.
محصولات مرتبط با این مطلب
مقالات مرتبط
